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              斑馬魚基因敲除突變體建立


              1.敲除原理

                功能缺失---基因敲除 (Gene Knockout)

                基因敲除 :將斑馬魚基因改變成無功能性基因(無效等位基因:null allele)的一種遺傳學技術

                【A gene knockout (KO) is a genetic technique in which one of an organism‘s genes is made inoperative. http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_knockout 】

                通過將基因敲除的個體與正常個體相比較,研究者可以揭示特定基因的功能。

                基因敲除技術特點:在基因組水平上將目標基因修改成無效等位基因,遺傳背景干凈清晰,是研究基因功能的金標準。

               

              2.服務流程

              3.服務信息

              流程分布

              周期(工作日)

              提交內容

              基因信息分析

              2

              專業分析報告

              sgRNA合成

              9

              獲得sgRNA并提供sgRNA合成階段報告

              sgRNA活性驗證

              5-10

              獲得有活性的sgRNA并提供活性報告

              F0代突變體鑒定

              40

              獲得F0代突變體并提供鑒定報告

              F1代突變體獲得

              60

              提供2尾(或以上)F1代突變體并提供總結報告

              總周期:4-5個月

               

               

               

               

              案例說明
              案例展示

              案例說明

              利用CRISPR技術建立動物基因敲除突變體的實驗流程

              (以斑馬魚基因為例)

                一、基因結構及功能的生物信息學分析

                二、CRISPR 設計

                三、目標序列的野生型等位基因的測序驗證

                3.1 擴增目標基因組片段的引物設計

                3.2 基因組DNA模板制備

                以斑馬魚為例,隨機選取5枚24 hpf胚胎,以《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》(南京堯順禹生物科技有限公司)制備斑馬魚基因組DNA模板。

                3.3 PCR產物電泳及測序驗證

                四、sgRNA體外表達模板的制備(質粒模板法)

                本實驗流程以南京堯順禹生物科技公司的二合一質粒pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA(含sgRNA骨架的質粒)質粒特征所設計。

                4.1 CRISPR寡核苷酸DNA(Oligo)對的設計

                4.2 向可信賴的商業公司訂購上述DNA引物(共2條,每個2 OD,RPC純化即可)。

                4.3 將正反向兩個引物進行退火

                4.4 將退火產物與線性化的pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA骨架質粒連接

                4.5 轉化

                4.6 轉化子鑒定

                2%瓊脂糖凝膠電泳,陽性克隆應出現113 bp的條帶(圖1):

                

               

              圖1:PCR驗證陽性克隆。Lane1:DNA Marker (從下往上, 100bp, 250 bp, 500bp, 750 bp, 1000bp, 3000bp, 5000bp);Lane 2-4: 陰性轉化子; Lane 5-9: 陽性轉化子

                4.7 測序驗證

                送2個經PCR驗證有陽性條帶的菌液去商業公司測序,測序引物為F-sgRNA,確認CRISPR序列(去除PAM位點)和骨架序列重組到pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA質粒中;同時,將同樣的細菌接種在10 ml含氨芐青霉素的LB管中,37oC條件下搖菌過夜。

                4.8 質粒抽提

                4.9 sgRNA模板的制備

                以上述質粒為模板,選用引物F-sgRNA和引物R-sgRNA作為一對引物,用高保真DNA聚合酶,通過PCR的方式,進行sgRNA模板的制備。

                五、sgRNA體外轉錄

                用Maxiscript T7 Kit (Ambion)試劑盒,按說明書的要求進行sgRNA的體外轉錄。

                說明:由于sgRNA在細胞內發揮作用的是RNA的形式,因而不需要戴帽以及加尾等操作。

                5.1 20 ml體外轉錄體系(依次加入)

                sgRNA模板:12 ml

                10mM ATP: 1 ml (NTP均需在冰上溶解)

                10mM CTP: 1 ml

                10mM GTP: 1 ml

                10mM UTP: 1 ml

                T7 RNA polymerase:2 ml

                10 × Transcription Buffer:2 ml (先在室溫下溶解,然后Vortex,再離心后使用)

                5.2 將上述溶液充分混勻后,離心,然后置于37℃水浴鍋中孵育1h。

                5.3 向反應體系中加入1ml DNase I,混勻,再次于37℃水浴鍋中孵育15min。

                5.4 向反應體系中加80 ml DEPC處理過的超純水,10 ml 無RNase的3M醋酸鈉(pH5.2),渦旋混勻,然后加300 ml 無RNase的無水乙醇(購買來未打開過的新的無水乙醇可視為無RNase,于-20℃中驟冷1小時以上。

                5.5 4℃,12000g 離心20min,棄上清。

                5.6 以70% 無RNase的乙醇清洗沉淀,4℃,12000g 離心5min,棄上清。

                5.7 然后再快速離心,將掛在離心管壁上的液體用移液器小心吸出。

                5.8 通風櫥中(打開抽氣開關)干燥(20min左右),若較長時間仍不能將沉淀物干燥,再次于4℃,12000g 離心5min,將掛在離心管壁上的液體用移液器(小量程的移液器)小心吸出。

                5.9 加10 ml DEPC處理超純H2O 溶解沉淀。

                5.10 取0.5 ml sgRNA用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測轉錄出的sgRNA條帶的完整性(圖2),并用紫外分光光度計測量轉錄出的sgRNA的濃度。

                5.11 合成出的sgRNA應及時進行分裝,保存在-80oC冰箱中,不要反復凍融,以免影響其質量。

                

               

              圖2、sgRNA (第2條泳道為sgRNA)

                六、sgRNA活性的測試

                將上述sgRNA和Cas9 蛋白混合,顯微注入斑馬魚受精卵,注射量為1nl。待胚胎發育至7-24 hpf時,取5枚胚胎,使用本公司生產的《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》制備基因組DNA模板,方法同前。

                然后以引物對F-gene和R-gene進行PCR擴增,將PCR產物分別亞克隆到pGEM-T Easy載體中。以引物對T7和Sp6對轉化子進行擴增,以篩選驗證。

                對篩選到的陽性轉化子,以T7和Sp6擴增產物為模板,F-gene和R-gene再次進行PCR擴增。然后,依據條帶大小,選20個克隆,5個一組,PCR產物等量混合后直接送測序。直接閱讀測序圖,只要其中任何一組出現有套峰,即假定制備的sgRNA活性不小于5%(1/20)。

                

               

              圖4 典型的測序套峰圖

                七、斑馬魚靶向基因突變體F0代的建立

                將上述經過驗證有活性的sgRNA和Cas9 蛋白等量混合后,按上述相同的方法顯微注入斑馬魚受精卵。然后將按常規飼養,當生長至兩月齡時,剪取尾鰭,按前述同樣的方法進行擴增目標基因組DNA片段。將獲得的PCR產物直接送測序,確認體細胞含靶向突變。然后將斑馬魚飼養至性成熟,共獲得約50尾后代。

                

               

              圖5 典型的體細胞含靶向突變的測序套峰圖

                八、斑馬魚基因靶向突變F1代的制備

                收取F0自交的胚胎,獲得不少于100尾以上的F1。將F1按常規飼養至2個月時,選取10尾魚,剪尾鰭,按前述方法進行基因型鑒定。簡單地說,用南京堯順禹生物科技有限公司的《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》制備基因組DNA模板,再以引物對F-gene和R-gene進行PCR擴增。將PCR產物直接送測序,通過直接讀測序的色譜圖,確認每一位魚是否攜帶等位基因突變。

                九、基因靶向突變體的擴群建系

                將攜帶基因靶向突變的F1突變體和野生型交配,獲得F2群,完成基因靶向突變體的建系擴群。

              參考文獻
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