利用CRISPR技術建立動物基因敲除突變體的實驗流程

(以斑馬魚基因為例)

　　一、基因結構及功能的生物信息學分析

　　二、CRISPR 設計

　　三、目標序列的野生型等位基因的測序驗證

　　3.1 擴增目標基因組片段的引物設計

　　3.2 基因組DNA模板制備

　　以斑馬魚為例，隨機選取5枚24 hpf胚胎，以《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》(南京堯順禹生物科技有限公司)制備斑馬魚基因組DNA模板。

　　3.3 PCR產物電泳及測序驗證

　　四、sgRNA體外表達模板的制備(質粒模板法)

　　本實驗流程以南京堯順禹生物科技公司的二合一質粒pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA(含sgRNA骨架的質粒)質粒特征所設計。

　　4.1 CRISPR寡核苷酸DNA(Oligo)對的設計

　　4.2 向可信賴的商業公司訂購上述DNA引物(共2條，每個2 OD，RPC純化即可)。

　　4.3 將正反向兩個引物進行退火

　　4.4 將退火產物與線性化的pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA骨架質粒連接

　　4.5 轉化

　　4.6 轉化子鑒定

　　2%瓊脂糖凝膠電泳，陽性克隆應出現113 bp的條帶(圖1)：

　　

 

圖1：PCR驗證陽性克隆。Lane1：DNA Marker (從下往上, 100bp, 250 bp, 500bp, 750 bp, 1000bp, 3000bp, 5000bp);Lane 2-4: 陰性轉化子; Lane 5-9: 陽性轉化子

　　4.7 測序驗證

　　送2個經PCR驗證有陽性條帶的菌液去商業公司測序，測序引物為F-sgRNA，確認CRISPR序列(去除PAM位點)和骨架序列重組到pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA質粒中;同時，將同樣的細菌接種在10 ml含氨芐青霉素的LB管中，37oC條件下搖菌過夜。

　　4.8 質粒抽提

　　4.9 sgRNA模板的制備

　　以上述質粒為模板，選用引物F-sgRNA和引物R-sgRNA作為一對引物，用高保真DNA聚合酶，通過PCR的方式，進行sgRNA模板的制備。

　　五、sgRNA體外轉錄

　　用Maxiscript T7 Kit (Ambion)試劑盒，按說明書的要求進行sgRNA的體外轉錄。

　　說明：由于sgRNA在細胞內發揮作用的是RNA的形式，因而不需要戴帽以及加尾等操作。

　　5.1 20 ml體外轉錄體系(依次加入)

　　sgRNA模板：12 ml

　　10mM ATP: 1 ml (NTP均需在冰上溶解)

　　10mM CTP: 1 ml

　　10mM GTP: 1 ml

　　10mM UTP: 1 ml

　　T7 RNA polymerase：2 ml

　　10 × Transcription Buffer：2 ml (先在室溫下溶解，然后Vortex，再離心后使用)

　　5.2 將上述溶液充分混勻后，離心，然后置于37℃水浴鍋中孵育1h。

　　5.3 向反應體系中加入1ml DNase I，混勻，再次于37℃水浴鍋中孵育15min。

　　5.4 向反應體系中加80 ml DEPC處理過的超純水，10 ml 無RNase的3M醋酸鈉(pH5.2)，渦旋混勻，然后加300 ml 無RNase的無水乙醇(購買來未打開過的新的無水乙醇可視為無RNase，于-20℃中驟冷1小時以上。

　　5.5 4℃，12000g 離心20min，棄上清。

　　5.6 以70% 無RNase的乙醇清洗沉淀，4℃，12000g 離心5min，棄上清。

　　5.7 然后再快速離心，將掛在離心管壁上的液體用移液器小心吸出。

　　5.8 通風櫥中(打開抽氣開關)干燥(20min左右)，若較長時間仍不能將沉淀物干燥，再次于4℃，12000g 離心5min，將掛在離心管壁上的液體用移液器(小量程的移液器)小心吸出。

　　5.9 加10 ml DEPC處理超純H2O 溶解沉淀。

　　5.10 取0.5 ml sgRNA用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測轉錄出的sgRNA條帶的完整性(圖2)，并用紫外分光光度計測量轉錄出的sgRNA的濃度。

　　5.11 合成出的sgRNA應及時進行分裝，保存在-80oC冰箱中，不要反復凍融，以免影響其質量。

　　

 

圖2、sgRNA (第2條泳道為sgRNA)

　　六、sgRNA活性的測試

　　將上述sgRNA和Cas9 蛋白混合，顯微注入斑馬魚受精卵，注射量為1nl。待胚胎發育至7-24 hpf時，取5枚胚胎，使用本公司生產的《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》制備基因組DNA模板，方法同前。

　　然后以引物對F-gene和R-gene進行PCR擴增，將PCR產物分別亞克隆到pGEM-T Easy載體中。以引物對T7和Sp6對轉化子進行擴增，以篩選驗證。

　　對篩選到的陽性轉化子，以T7和Sp6擴增產物為模板，F-gene和R-gene再次進行PCR擴增。然后，依據條帶大小，選20個克隆，5個一組，PCR產物等量混合后直接送測序。直接閱讀測序圖，只要其中任何一組出現有套峰，即假定制備的sgRNA活性不小于5%(1/20)。

　　

 

圖4 典型的測序套峰圖

　　七、斑馬魚靶向基因突變體F0代的建立

　　將上述經過驗證有活性的sgRNA和Cas9 蛋白等量混合后，按上述相同的方法顯微注入斑馬魚受精卵。然后將按常規飼養，當生長至兩月齡時，剪取尾鰭，按前述同樣的方法進行擴增目標基因組DNA片段。將獲得的PCR產物直接送測序，確認體細胞含靶向突變。然后將斑馬魚飼養至性成熟，共獲得約50尾后代。

　　

 

圖5 典型的體細胞含靶向突變的測序套峰圖

　　八、斑馬魚基因靶向突變F1代的制備

　　收取F0自交的胚胎，獲得不少于100尾以上的F1。將F1按常規飼養至2個月時，選取10尾魚，剪尾鰭，按前述方法進行基因型鑒定。簡單地說，用南京堯順禹生物科技有限公司的《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》制備基因組DNA模板，再以引物對F-gene和R-gene進行PCR擴增。將PCR產物直接送測序，通過直接讀測序的色譜圖，確認每一位魚是否攜帶等位基因突變。

　　九、基因靶向突變體的擴群建系

　　將攜帶基因靶向突變的F1突變體和野生型交配，獲得F2群，完成基因靶向突變體的建系擴群。